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本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
  
• 独特的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
  
• 快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

• RNaseA保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，长期保存放-20℃。
  
• 第一次使用时，可将试剂盒所带全部的RNaseA加入溶液P1后置于4℃可保存3个月左右。如果溶液P1中RNaseA时间较久失活了，提取的质粒可能有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNaseA即可。
  
• 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出，出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清，重新混匀，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

• 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12000rpm的台式离心机。
  
• 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议接种单菌落于1.5～4.5mL加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14～16个小时，可提取出多达20～30μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5～10mL过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。
  
• 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mlDNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
  
• 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。
  
• 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

• 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶和去蛋白液PE瓶中按标签指示加入无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 将RNaseA全部加入溶液P1中，混匀。每次使用后置于2～8℃保存。

• 柱平衡：向吸附柱AC中加入100μL平衡液，12000rpm离心1min，弃滤液，备用。
  
  • 平衡液可以增强硅胶膜的吸附核酸能力，请使用当天处理的吸附柱。
• 取1.5～5mL过夜培养的菌液加入1.5mL离心管，12000rpm离心30sec，尽可能的倒干上清，收集菌体。
  
  • 如使用收集超过1.5mL菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5mL管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
• 加250μL溶液P1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
  
  • 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
• 加250μL的溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，室温放置4～5min。
  
  • 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5min！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
• 加350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，小心吸取上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），避免吸取到漂浮的白色沉淀。
  
  • 加入溶液P3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
• 12000rpm离心1min，弃滤液。
  
• 加入500μL去蛋白液PE（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30sec，弃滤液。
  
• 加入600μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30sec，弃滤液。再加入600μL漂洗液WB重复漂洗一次，弃滤液。
  
• 将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL～100μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在80℃～90℃水浴中预热可提高产量），室温放置2min，12000rpm离心1min，弃吸附柱。
  
  • 推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min。洗脱两遍可提高浓度约10%。
    
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于30μL）。